基因型

E.coli B F– ompT hsdS(rB–mB–) dcm+TetR gal λ(DE3) endA Hte [cpn10cpn60 GentR]pRARE2(CamR)

簡(jiǎn)要說(shuō)明

ArcticExpress (DE3) pRARE2來(lái)源于ArcticExpress (DE3)，將具有l(wèi)u霉素抗性的pRARE2質(zhì)粒導(dǎo)入ArcticExpress (DE3)細(xì)胞中即是ArcticExpress(DE3)pRARE2。ArcticExpress (DE3) pRARE2菌株染色體DNA中整合了λ噬菌體DE3區(qū)，使得ArcticExpress (DE3) pRARE2菌株可同時(shí)表達(dá)T7RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶，廣泛用于pET系列，pGEX，pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達(dá)。ArcticExpress (DE3)pRARE2菌株具有四環(huán)素，qing大霉素，lu霉素抗性，endA1突變有利于質(zhì)粒DNA的穩(wěn)定。[cpn10cpn60 GentR]的存在使ArcticExpress(DE3)pRARE2可以表達(dá)適應(yīng)低溫的伴侶蛋白Cpn10和Cpn60（來(lái)自嗜冷菌—Oleispira antarctica）。Cpn10和Cpn60伴侶蛋白在4-12℃表現(xiàn)出較高活性，在ArcticExpress(DE3) pRARE2細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，可降低重組蛋白包涵體的形成，增加可溶重組蛋白的表達(dá)量及生物活性，比傳統(tǒng)的原核表達(dá)伴侶蛋白GroEL、GroES等具有更加優(yōu)異的促融能力。同時(shí)，pRARE2質(zhì)粒可補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的7種稀有密碼子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA和CGG)對(duì)應(yīng)的tRNA，提高外源基因的表達(dá)水平。ArcticExpress(DE3) pRARE2感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率達(dá)108cfu/µg DNA。

操作說(shuō)明

1、ArcticExpress (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，待菌塊融化，加入目的質(zhì)粒，并用手撥EP管底混勻，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率

3. 向離心管中加入700 µl不含抗生素的無(wú)菌LB培養(yǎng)基，混勻后37℃，200rpm復(fù)蘇60分鐘。

4. 5000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 µl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基上（平板中務(wù)必同時(shí)含有34µg/ml的lu霉素，40µg/ml的qing大霉素和轉(zhuǎn)化質(zhì)粒本身的篩選抗生素；若質(zhì)粒濃度較高，也可稀釋后涂板，務(wù)必保證能在平板上挑到單克隆菌落）。

5. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)

1、ArcticExpress (DE3) pRARE2感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，待菌塊融化，加入目的質(zhì)粒，并用手撥EP管底混勻，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。 

3. 向離心管中加入700 µl不含抗生素的無(wú)菌LB培養(yǎng)基，混勻后37℃，200 rpm復(fù)蘇60分鐘。

4. 5000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 µl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基上（平板中務(wù)必同時(shí)含有34µg/ml的lu霉素，40µg/ml的qing大霉素和轉(zhuǎn)化質(zhì)粒本身的篩選抗生素；若質(zhì)粒濃度較高，也可稀釋后涂板，務(wù)必保證能在平板上挑到單克隆菌落）。

5. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。