基因型

F- ompT hsdSB(rB- mB- ) gal dcm rne131 (DE3)

簡(jiǎn)要說(shuō)明

BL21 Star(DE3)感受態(tài)細(xì)胞來(lái)源于BL21(DE3)菌株，含有rne131基因突變體，rne131突變基因能夠增強(qiáng)菌株細(xì)胞內(nèi)mRNA的穩(wěn)定性，從而提高蛋白表達(dá)能力。主要適用于T7啟動(dòng)子表達(dá)載體(如pET系列)的高水平蛋白表達(dá)。BL21 Star(DE3)感受態(tài)細(xì)胞由特殊工藝制作，經(jīng)pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率達(dá)108cfu/μg。

操作說(shuō)明

1、取100μl冰上融化的BL21 Star(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，加入目的質(zhì)粒并輕輕混勻，冰上靜置25分鐘。

2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。 

3.向離心管中加入700μl不含抗生素的無(wú)菌2YT或LB培養(yǎng)基，混勻后37℃，200rpm復(fù)蘇60分鐘。

4.5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。

5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。

注 意：

1.Brian Caliendo (Voigt 實(shí)驗(yàn)室)報(bào)道過(guò)pCP20質(zhì)粒比較難于轉(zhuǎn)化到這個(gè)感受態(tài)細(xì)胞中，而pCP20轉(zhuǎn)化到其他菌株中都很正常，但是菌體原因未知。

2.即使不加葡萄糖，BL21(AI) 細(xì)胞的araBAD啟動(dòng)子下游的本底蛋白表達(dá)水平仍然很低，加入葡萄糖后能夠進(jìn)一步的降低本底蛋白的表達(dá)水平。

注意事項(xiàng)

1、感受態(tài)細(xì)胞最好在冰上融化。插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間存放會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。 

2.混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。

3.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

4.誘導(dǎo)時(shí)，IPTG濃度可選（0.1-2mM均可）。

5.為獲得需要量的蛋白，最佳誘導(dǎo)時(shí)間、溫度以及IPTG濃度需實(shí)驗(yàn)者優(yōu)化